ÚLOHA OXIDU DUSNATÉHO V PATOGENEZI PLICNÍ HYPERTENZE

Václav Hampl

Ústav fysiologie
Druhá lékařská fakulta University Karlovy v Praze


Disertační práce k získání hodnosti doktora věd


Číslo a název vědního oboru: 51-02-9 Normální a patologická fysiologie


Praha 2000

Abstrakt
Jedním z nejvýznamnějších rozdílů mezi malým a velkým oběhem je výrazně nižší krevní tlak a hemodynamický odpor v malém oběhu. Po objevu ednogenní tvorby oxidu dusnatého (NO) a jeho vazodilatačního působení se předpokádalo, že v plicní cirkulaci může existovat vysoká tonická produkce NO, která by tak přispívala k nízkému bazálnímu tonu hladkého svalu plicních cév. Neschopnost z různých důvodů udržet tuto vysokou produkci NO by pak vedla k rozvoji plicní hypertenze. Značné experimentální úsilí, shrnuté v tomto spisu, však postupně ukázalo, že ve skutečnosti se tato představa neuplatňuje. Zdravé plicní cévy totiž tvoří za normálních podmínek pouze malé množství NO. Při plicní hypertenzi syntéza NO stoupá. Rozvoj plicní hypertenze je tímto protektivním mechanismem částečně tlumen, alespoň dokud nedojde k poškození endotelu trvale výrazně zvýšeným tlakem. Je ovšem možné, že zvýšená tvorba NO může k rozvoji plicní hypertenze i přispívat tím, že společně se superoxidem, rovněž produkovaným v plicních cévách, tvoří vysoce reaktivní a cytotoxický peroxynitrit. Ten může přispívat k poškození plicní cévní stěny, které je podkladem rozvoje plicní hypertenze.


Úvodní poznámky
1. CÍL A FORMÁT PRÁCE
Cílem tohoto spisu je shrnutí mých experimentů věnovaných charakterizaci podílu oxidu dusnatého (NO) na regulaci plicní cirkulace ve zdraví a zejména při plicní hypertenzi, jakož i vsazení těchto mých zjištění do kontextu výsledků ostatních autorů, zabývajících se tímto tématem. Klíčovou částí je proto přehledný článek na toto téma, přijatý prestižním časopisem Physiological Reviews [1] (impakt faktorem >23.6 se řadí na 8. místo mezi všemi biomedicínskými časopisy). Tento rozsáhlý text je doplněn mými primárními publikacemi, z nichž přehled vychází, a úvodním nástinem problematiky.

2. NÁSTIN PROBLEMATIKY
2.1. Úvod: plicní cirkulace a NO
Plicní krevní oběh je unikátním cévním řečištěm, protože má význam zcela odlišný od ostatních orgánových řečišť [2]. Kyslík v ní není odevzdáván z krve do okolí cév (tkání); naopak, kyslík se v plicní cirkulaci dostává z okolí cév (alveolů) do krve. Tomu odpovídají významné rozdíly funkce a regulace. Hemodynamický odpor a tlak krve je v plicním oběhu přibližně pět až šestkrát nižší než v systémové cirkulaci. Plicní cévy mají mimořádně tenkou stěnu a minimální klidovou (bazální) tenzi.

Chronické poškození plicních cév se manifestuje plicní hypertenzí [3]. Přestože různé formy plicní hypertenze jsou poměrně časté a jsou spojeny se značnou morbiditou a mortalitou, mechanismus vzniku této poruchy není jasný. Proto jsou i možnosti účinné prevence a léčby plicní hypertenze nedostatečné.

Když byla koncem osmdesátých let objevena schopnost eukaryotických organismů syntetizovat NO a využívat ho jako endogenní vasodilatační faktor [4,5], nabízela se logicky hypotéza, podle níž by stálá, poměrně vysoká klidová tvorba NO v plicních cévách mohla být zodpovědná za nízký klidový tonus plicních cév. Podle této představy by také porucha této předpokládané vysoké produkce NO v plicních cévách mohla být podkladem plicní hypertenze. Tato možnost byla zvláště lákavá vzhledem k tomu, že v patogeneze mnohých forem plicní hypertenze figuruje větší nebo menší měrou hypoxie [3]. Molekulární kyslík je substrátem NO syntázy a lze tedy očekávat, že jeho nedostatek může omezit tvorbu NO.

Z těchto důvodů jsme při zahájení experimentálního studia této problematiky naplánovali 3 hlavní oblasti, které bylo nutno prozkoumat:
Klidová produkce NO v plicní cirkulaci a její úloha v regulaci bazálního tonu.
Vliv hypoxie na syntézu NO v plicní cirkulaci a jeho podíl na regulaci tonu za těchto podmínek.
Produkce a funkce NO v plicních cévách při plicní hypertenzi.

2.2. Metodiky
Všechny pokusy autora byly provedeny v souladu s příslušnými předpisy na ochranu laboratorních zvířat a humánní zacházení s nimi a byly schváleny příslušnými etickými komisemi.

2.2.1. Měření NO
Pro stanovení úrovně tvorby NO v plicních cévách je optimálním přístupem její přímé měření. Toto banální prohlášení ovšem není snadné prakticky realizovat vzhledem k velmi rychlé oxidaci NO v přítomnosti kyslíku a k extrémně rychlé inaktivaci oxidu dusného hemoglobinem a superoxidem. Velmi malá množství NO, obvykle tvořená v normálních cévách, dále znesnadňují analýzu. Vyvinuli jsme proto postup, při němž se měří akumulace NO a jeho oxidačních produktů, NO2- a NO3-, v recirkulujícím médiu [6,7]. Tím byl buď arteficielní perfuzát izolovaných plic laboratorního potkana [6] anebo superfuzát omývající kulturu plicních endoteliálních buněk in vitro [7]. Použití umělého média namísto krve pro perfúzi izolovaných plic eliminovalo problém s okamžitým odstraněním oxidu dusnatého hemoglobinem. Oxidy dusíku (NO + NO2- + NO3-, [NOx]) jsme stanovovali "zlatým standardem" analýzy NO, chemiluminescenční metodou [8]. Náš postup měření produkce NO v izolovaných perfundovaných plicích [6] následně převzali další autoři [9,10].

2.2.2. Inhibitory NO syntázy
Měření produkce NO je esenciální, avšak pro pochopení jejího funkčního významu jsou nutné další přístupy, zejména sledování důsledků aplikace farmakologických blokátorů NO syntázy. Poměrně selektivních kompetitivních inhibitorů na bázi strukturních modifikací L-argininu (substrátu NO syntázy) je k dispozici celá řada (např. NG-monomethyl-L-arginin [L-NMMA], NG-nitro-L-arginin [L-NA], nebo L-NA methyl ester [L-NAME]). Potenciálním problémem tohoto přístupu je účast NO ve velmi širokém spektru fysiologických a patofysiologických funkcí. Pozorovaný účinek inhibitoru NO syntázy proto nemusí být vždy přímým důsledkem absence NO ve sledovaném systému, nýbrž může být vyvolán nějakým působkem, uvolněným (nebo naopak utlumeným) jako kompenzace chybějícího NO z tkáně mimo oblast aktuálního experimentálního zájmu. V poslední době skutečně přibývá důkazů, že za určitých podmínek může takto fungovat zvýšené uvolňování prostacyklinu nebo snížené uvolňování endotelinu [9,10]. Toto metodologické omezení jsme se snažili obejít doplněním pokusů in vivo [11,12] měřeními na izolovaných plicích [6,13] a plicních cévách [14,15], kde lze, zejména při vyloučení krve z perfuzátu, minimalizovat vlivy z ostatních orgánů.

2.2.3. Další metody
Řada autorů se zabývala expresí genů pro NO syntázy, t.j. kvantifikací příslušných mRNA a proteinů. V našich studiích však tyto metody nebyly použity. V poslední době se objevily studie na geneticky manipulovaných myších s nefunkčním genem pro některou ze tří NO syntáz [16-19].

2.3. Výsledky a diskuse
2.3.1. Klidová produkce NO v plicní cirkulaci
Na základě objevu trvalé (tonické) produkce NO v plicním oběhu [20,21] předpokládaly první úvahy o působení NO v plicním oběhu, že i tam existuje tonická produkce NO. Mimořádně vysoká úroveň této bazální tvorby vazodilatačního NO by pak mohla přispívat k nízkému klidovému tonu plicních cév [22,23].

Prvním z přístupů, použitých k ověření této možnosti, byla akutní aplikace inhibitoru NO syntázy (L-NMMA) v izolovaných perfundovaných plicích laboratorního potkana [24]. Výsledkem bylo jen zcela minimální zvýšení plicního cévního odporu. To naznačilo, že v plicních cévách nejspíše neprobíhá hemodynamicky významná stálá klidová produkce NO. Tento nález byl v průběhu mé práce na tomto tématu potvrzen dalšími autory [25-27]. Společným problémem všech těchto studií ovšem byla nedostatečná selektivita použitých inhibitorů. Např. nezvýšený bazální tonus po podání L-NMMA [24-26] má omezenou vypovídací schopnost o úloze NO vzhledem k našemu následnému zjištění, že L-NMMA může ve skutečnosti syntézu NO potencovat [14]. Proto jsme se rozhodli tuto otázku důkladně prověřit pomocí několika různých inhibitorů NO syntázy a přímým měřením tvorby NO.

Zjistili jsme, že stejně jako L-NMMA, také další, specifičtější inhibitory NO syntázy (L-NAME, L-NA) nepůsobí při akutním podání do izolovaných plic potkana signifikantní vazokonstrikci [6,13,28]. Přímé srovnání se systémovou cirkulací ukázalo, že dávka L-NAME nebo L-NA, která působí velmi výraznou systémovou vazokonstrikci, je v plicní cirkulaci zcela bez efektu [13,28]. Podíl stálé klidové produkce NO na udržování bazálního tonu je tedy ve srovnání s cévním řečištěm v plicním oběhu minimální.

Tento závěr potvrdila i studie s chronickým podáváním L-NAME laboratorním potkanům [11]. Předpokládali jsme, že pokud by se stálá klidová produkce NO podílela na udržování nízkého plicního cévního odporu, pak by chronická inhibice NO syntázy měla vést k plicní hypertenzi. Zjistili jsme, že tomu tak není - tlak v plícnici nebyl zvýšen u potkanů, kteří dostávali L-NAME ve vodě na pití po dobu 3 týdnů [11].

Přestože tyto výsledky jsou dohromady dosti přesvědčivou podporou tvrzení, že v normálních, zdravých plicích je klidová produkce NO hemadynamicky nevýznamná, definitivním potvrzením toho, že je minimální, mohlo být pouze její přímé měření. To jsme realizovali jak v celých perfundovaných plicích [6], tak v kultuře plicních endoteliálních buněk [7]. V obou případech jsme potvrdili, že klidová tvorba NO je pod detekčním limitem i vysoce citlivé chemiluminescenční metody. Významné množství NO není detekovatelné ani ve vzduchu vydechovaném z distálních dýchacích cest člověka [29] či laboratorního potkana [30].

2.3.2. Vliv hypoxie na syntézu NO v plicní cirkulaci
Další oblastí, na níž jsme se zaměřili, bylo ovlivnění tvorby NO v plicní cirkulaci hypoxií. Tato otázka je relevantní ze dvou důvodů. Jednak proto, že hypoxie je pro plicní cévy nejvýznmanějším stimulem z hlediska regulace distribuce průtoku. Působí totiž plicní vazokonstrikci, která redistribuje průtok krve z hůře do lépe ventilovaných částí plic. Navíc dlouhotrvající hypoxie významně přispívá i k patogenezi morfologické přestavby cévní stěny, která je podkladem chronické plicní hypertenze. Druhým důvodem je skutečnost, že molekulární kyslík je jedním ze substrátů NO syntázy, a je proto na místě očekávat, že jeho nedostatek může tvorbu NO omezovat. Hypoxickou vazokonstrikci by pak bylo možno vysvětlit jako důsledek hypoxií snížené produkce vazodilatačního NO.

Již první pokusy zaměřené na tuto problematiku ovšem tuto možnost nepotvrdily. Archer se spolupracovníky [24] ukázali, že inhibice NO syntázy (L-NMMA) potencuje hypoxickou plicní vazokonstrikci. To naznačilo, že syntéza NO je v plicních cévách při hypoxii spíše zvýšená. Toto pozorování bylo později zopakováno v řadě dalších studií [25-27,31], včetně našich [6]. Alternativním vysvětlením těchto poznatků by ovšem mohla být hypoxií zvýšená citlivost cévního hladkého svalu k NO. Později bylo skutečně ukázáno, že hypoxie ovlivňuje guanylát cyklázu (vnitrobuněčný "receptor" pro NO). Proto jsme přistoupili k přímému měření tvorby NO v plicních cévách. Měřili jsme akumulaci NO a jeho oxidačních produktů (NOx) v superfuzátu kultury hovězích plicních endoteliálních buněk během normoxie a hypoxie. Zjistili jsme, že zatímco za normoxie byla akumulace NOx minimální, při hypoxii se rychlost hromadění NOx signifikantně zvýšila [7].

Zvýšená syntéza NO v plicních cévách při hypoxii byla poněkud překvapivá vzhledem k požadavku NO syntázy na molekulární kyslík. Předpokládali jsme, že k vysvětlení může přispívat vysoká afinita NO syntázy ke kyslíku [32]. K poklesu tvorby NO díky tomu vede teprve až velmi drastické snížení dostupnosti kyslíku blízké anoxii. V této souvislosti je dobře si uvědomit, že in vivo nemůže PO2 v plicní cirkulaci poklesnout pod ~40 mmHg ani za mimořádně extrémních podmínek [33]. To je hodnota, představující zřejmě dostatečnou dostupnost O2 pro normální a dokonce i zvýšenou aktivitu NO syntázy.

Není-li aktivita NO syntázy v plicních cévách in vivo regulována dostupností O2 jako substrátu, musí existovat jiný způsob, jakým hypoxie ovlivňuje produkci NO. Jedním z nejvýznamnějších a nejlépe popsaných mechanismů regulace endoteliální NO syntázy je prostřednictvím intracelulárního Ca2+. Jeho zvýšení v endoteliálních buňkách - i jen přechodné - je mohutným stimulem pro tvorbu NO [34-36]. Logickým dalším krokem tedy bylo změřit vliv hypoxie na intracelulární koncentraci Ca2+ ([Ca2+]i) v buňkách plicního endotelu. S použitím fluorescenčního Ca2+ indikátoru fura-2 a duální spektrofluoroskopie [37] jsme zjistili, že hypoxie přechodně výrazně zvyšuje [Ca2+]i v izolovaných plicních endoteliálních buňkách [7]. Tento vzestup nebyl způsoben vstupem Ca2+ z extracelulární tekutiny, nýbrž byl důsledkem uvolnění Ca2+ z endoplasmatického retikula.

Tyto nálezy dohromady ukazují, že i přes poněkud sníženou dostupnost substrátu vede hypoxie v plicním endotelu ke zvýšení aktivity NO syntázy tím, že působí vyplavení Ca2+ z endoplasmatického retikula.

2.3.3. NO při plicní hypertenzi
Výše diskutovaná důkladná evidence proti existenci hemodynamicky významné klidové tvorbě NO ve zdravé plicní cirkulaci v podstatě odmítla i původně uvažovanou možnost, že by pokles klidové tvorby vazodilatačního NO mohl být zodpovědný za rozvoj plicní hypertenze. Tím však možnost účasti NO v mechanismu plicní hypertenze nebyla zcela vyloučena. Zbývala ještě opačná možnost, že by totiž tvorba NO mohla být během plicní hypertenze zvýšená, snad jako zpětnovazební pokus o omezení přílišného přírůstku intravaskulárního tlaku. Tento směr podpořilo i zjištění, že hypoxie stimuluje tvorbu NO v plicním endotelu (viz výše).

Protože endogenní NO byl původně objeven jako endoteliální relaxační faktor zprostředkující cévní odpověď na některé vazodilatační látky [4], bylo na místě nejprve se zajímat o to, zda při chronické plicní hypertenzi není reaktivita na tyto látky změněná. Záhy se totiž objevily údaje o poklesu této reaktivity [22,23], což bylo interpretováno jako podpora názoru, že plicní hypertenze je důsledkem poklesu endoteliální produkce NO. V našich vlastních pokusech jsme ovšem získali výsledky přesně opačné: Vazodilatační reaktivita izolovaných plic na substanci P - která je v tomto preparátu závislá na NO - byla u potkanů s chronickou plicní hypertenzí signifikantně zvýšená [6,11,15,38]. Toto naše pozorování bylo záhy potvrzeno řadou laboratoří [39-43]. Důvod neshody těchto výsledků s výše zmíněnými iniciálními pozorováními [22,23] není úplně jasný. V každém případě je zřejmé, že převaha experimentálních údajů svědčí proti redukované NO-dependentní plicní vazodilataci při plicní hypertenzi.

Tyto výsledky však nebyly definitivní odpovědí na otázku úlohy NO v plicní hypertenzi, a to nejen kvůli tomuto rozporu. Změněná reaktivita na endotel-dependentní vazodilatancia totiž může být důsledkem nejen změněné schopnosti syntetizovat NO, ale i změněného počtu či citlivosti receptorů pro studované látky či změněné reaktivity cévního hladkého svalu na NO. Proto bylo nutno použít i další experimentální přístupy.

V další studii jsme vyšli z předpokladu, že pokud by plicní hypertenze byla důsledkem nedostatku endogenního NO, pak by mělo být možné vyvolat plicní hypertenzi chronickou farmakologickou inhibicí NO syntázy. Tento předpoklad se nepotvrdil - potkani, kterým byl po dobu 3 týdnů přidáván do vody na pití inhibitor NO syntázy (L-NAME), neměli zvýšený tlak krve v plícnici [11]. Přitom dostatečnost použité dávky a způsobu podávání byla potvrzena přítomností výrazné systémové hypertenze. Akutní přidání inhibitoru NO syntázy do perfuzátu plic izolovaných z potkanů s plicní hypertenzí vedlo ke značné vazokonstrikci, zatímco v plicích potkanů kontrolních byl tento zásah bez odezvy [6,31,39,44,45].

Tyto výsledky ukázaly, že význam NO pro regulaci cévního tonu při plicní hypertenzi nejen neklesá, nýbrž naopak vzrůstá. Stejně jako v obdobném případě akutní hypoxické vazokonstrikce se může jednat o jakési zpětnovazební omezení excesívního vzestupu intravaskulárního tlaku a následného rizika poškození tenkého alveolokapilárního rozhraní. Abychom rozhodli, zda uvedená pozorování jsou důsledkem skutečně zvýšené tvorby NO anebo zvýšené citlivosti k NO, přistoupili jsme k přímému měření akumulace NO a jeho oxidačních produktů (NOx) v perfuzátu izolovaných plic. Zjistili jsme, že akumulace NOx v perfuzátu byla významně vyšší u plic izolovaných z potkanů s plicní hypertenzí než u plic kontrolních (kde byla pod detekčním limitem vysoce citlivé chemiluminescenční metody) [6]. Později bylo zjištěno, že konverze triciem značeného L-argininu na [3H]citrulin v plicním homogenátu je potencována u potkanů s plicní hypertenzí [46,47].

Náš závěr, že chronická hypoxická plicní hypertenze není NO deficientním stavem, a že naopak syntéza NO je při ní zvýšená, potvrdily studie exprese NO syntázy v plicích. Histochemická a imunohistochemická lokalizace NO syntázy ukázala, že enzym chybí v endotelu a hladkém svalu odporových plicních cév kontrolních potkanů, avšak je tam bohatě exprimován u potkanů s chronickou hypoxickou plicní hypertenzí [46,47].

2.4. Perspektivy
Výsledky stručně shrnuté v těchto úvodních poznámkách a podrobně diskutované v přehledném článku na následujících stránkách postupně posunuly převládající mínění odborné veřejnosti od předpokladu, že plicní hypertenze je důsledkem NO deficience, k přesvědčení, že je tomu naopak - totiž že rozvoj plicní hypertenze je doprovázen zvýšením normálně nízké úrovně tvorby NO v plicních cévách. Je ovšem pravděpodobné, že v terminálních stádiích těžké plicní hypertenze, kdy dochází k rozsáhlému poškození plicní endoteliální výstelky, je tato schopnost bránit se přílišnému zvýšení tlaku nadprodukcí vazodilatačního NO vážně narušena, což dále přispívá ke zhoršení stavu.

Předpoklad, že zvýšená tvorba NO při plicní hypertenzi omezuje její rozvoj, se zdá logická. Nicméně existuje i alternativní možnost. NO je reaktivní radikál a mimořádně rychle reaguje zejména se superoxidem, jehož tvorba je v plicním cévním řečišti při plicní hypertenzi rovněž zvýšená [48,49]. Produktem této reakce je vysoce reaktivní a cytotoxický peroxynitrit. Je tedy možné, že zvýšená produkce NO při plicní hypertenzi může za jistých okolností - např. při koexistujícím zánětu, který dále podstatně zvyšuje tvorbu superoxidu - vést k nadprodukci peroxynitritu a tím přispívat k poškození cévní stěny. To je, spolu s následnou reparací, podkladem plicní hypertenze. V plazmě laboratorních potkanů s experimentální plicní hypertenzí je skutečně možno detekovat zvýšenou koncentraci nitrotyrosinu, který je markerem přítomnosti nitrotyrosinu [50]. Je tedy možné, že - tak jako v jiných orgánech - NO je v plicní cirkulaci dvousečnou zbraní. Na jedné straně může svým vazodilatačním působením rozvoj plicní hypertenze omezovat. Na druhé straně může prostřednictvím peroxynitritu poškození cévní stěny - a tedy plicní hypertenzi - prohlubovat. Posouzení významnosti těchto dvou tváří NO při různých typech plicní hypertenze je výzvou pro další výzkum této fascinující molekuly.

3. Literatura
citovaná v úvodních poznámkách