ÚČINKY HYPOXIE NA PLICNÍ A FETOPLACENTÁRNÍ CÉVY

Václav Hampl

Ústav fysiologie
Druhá lékařská fakulta University Karlovy v Praze

TÉZE PROFESORSKÉ INAUGURAČNÍ PŘEDNÁŠKY (2001)

Praha 2000

____________

Moje dosavadní experimentální úsilí lze zhruba shrnout do dvou hlavních okruhů. Jedním je role oxidu dusnatého v plicní cirkulaci. Ta byla tématem mé habilitační přednášky a doktorské disertace. V této přednášce se proto zaměřím na druhý, byť související, okruh otázek. Ten se týká vlivu, jaký má nedostatek kyslíku na ty cévy, jejichž hlavní funkcí je zajistit, aby se kyslík vůbec dostal do krve. Řeč tedy bude hlavně o plicních a do jisté míry i o fetoplacentárních cévách. Mým úmyslem v této přednášce je dokumentovat tři velmi rozdílné aspekty působení hypoxického stimulu na tyto cévy, každý se specifickými projevy a mechanismy: akutní, chronický a "opožděný". "Opožděnými" rozumím ty následky hypoxie, které se mohou projevit až velmi dlouhou dobu po jejím ukončení a po (zdánlivém) zotavení z jejích akutních či chronických důsledků.


Akutní účinky hypoxie

Již déle než půl století je dobře známo, že hypoxie působí v malém oběhu výraznou vazokonstrikci [1]. Tím se plicní cévy nápadně liší od cév velkého oběhu, kde hypoxie buď působí vasodilataci, nebo je bez efektu. Význam hypoxické plicní vazokonstrikce (HPV) spočívá v převedení průtoku krve z hůře ventilovaných částí plic ve prospěch oblastí ventilovaných lépe. Tím je optimalizováno okysličování krve.

Mechanismus HPV není dostatečně jasný. Je však vcelku jasné, že HPV je podmíněna vzestupem intracelulární koncentrace Ca2+ [Ca2+]i [2, 3]. Možnost inhibovat HPV blokátory napětím řízených Ca2+ kanálů [2] naznačila, že důležitým krokem mechanismu HPV může být depolarizace buněčné membrány hladkého svalu. Protože jednou z klíčových determinant membránového potenciálu v hladkém svalu je aktivita draslíkových (K) kanálů [4], předpokládali jsme, že hypoxie může vést ke kontrakci plicního cévního hladkého svalu tím, že uzavře jeho K kanály.

První poukaz na pravděpodobnou roli K kanálů v HPV publikoval Post se spolupracovníky [5]. My jsme se v zápětí zaměřili na přesnější identifikaci, o jaký typ K kanálu může jít [6]. Jenom takováto identifikace totiž slibuje jak přesné pochopení mechanismu HPV, tak zejména případné cílené terapeutické ovlivnění. S použitím metod terčíkového zámku ("patch clamp") jsme zjistili, že dominantní determinantou membránového potenciálu většiny buněk hladkého svalu periferních plicních arteriol (o nichž je známo, že jsou hlavním efektorem HPV) je aktivita rodiny K kanálů zvaných napětím řízené K kanály (Kv kanály). Ukazovaly na to elektrofyziologické vlastnosti a profil citlivosti na selektivní inhibitory různých rodin K kanálů. Prokázali jsme, že hypoxie selektivně snižuje pravděpodobnost otevřeného stavu těchto kanálů a tím působí depolarizaci těchto buněk a vazokonstrikci [6].

Identifikace K kanálů jako klíčového článku mechanismu HPV pomohlo osvětlit naše dřívější výsledky s respiračním stimulantem almitrinem. Ten v nízké dávce výrazně potencuje HPV, zatímco ve vyšší dávce vede ke vzrůstu normoxického plicního cévního odporu na úroveň, kterou už pak není dále možno zvýšit hypoxií [6a]. Od té doby se ukázalo, že respirační stimulancia jako almitrin působí snížením aktivity K kanálů v karotických tělískách, což vede k jejich depolarizaci a následně ke zvýšené aferentaci do dechového centra. Nižší dávka působila podobným způsobem na plicní cévy - částečným snížením aktivity K kanálů usnadnila jejich uzavření při hypoxii. Vyšší dávka uzavřela K kanály stejně jako hypoxie a tak působila jako jakési "mimetikum" hypoxie.

Obdobný mechanismus ostatně může přispívat k záhadnému a klinicky velmi významnému fenoménu plicní hypertenze vyvolané anorektiky [6b]. Zjistili jsme, že jedno z nejpoužívanějších, ale i z tohoto hlediska nejnebezpečnějších anorektik, (dex)fenfluramin, inhibuje Kv kanály v hladkém svalu plicních arteriol a tím vede k plicní vazokonstrikci [6c], i když významnou úlohu hraje také aktivace serotoninových receptorů fenfluraminem [6d].

Toto zúžení pátrání po typu K kanálu zprostředkujícího HPV bylo významné, nikoliv však dostatečné. Kv kanály jsou totiž rozsáhlou rodinou se značnými rozdíly mezi jednotlivými členy. Nicméně detailní srovnání farmakologických a elektrofyziologických vlastností K kanálu citlivého na hypoxii, zjištěných v naší studii, s publikovanými profily jednotlivých členů super-rodiny Kv kanálů výrazně zredukovalo okruh "podezřelých" prakticky jen na dva - kanály označované jako Kv1.5 a Kv2.1. V další experimentální práci jsme se proto zaměřili na objasnění jejich úlohy.

Použili jsme komerčně dostupné protilátky proti každému z obou "podezřelých" kanálů [7]. Nejdříve jsme imunohistochemickými metodami zjistili, že oba kanály jsou v hladkém svalu periferních plicních cév exprimovány. V "patch clamp" pokusech vyvolala protilátka proti Kv2.1 zřetelnou depolarizaci. V souladu s tím vyvolala anti-Kv2.1, ne však anti-Kv1.5, zvýšení klidové tenze periferních plicních arteriol. Zvýšení [Ca2+]i vyvolané v buňkách plicního cévního hladkého svalu hypoxií bylo inhibováno protilátkou proti Kv1.5, ne však proti Kv2.1. Anti-Kv1.5 protilátka signifikantně inhibovala HPV v izolovaných perfundovaných plicích, zatímco efekt anti-Kv2.1 nebylo možno v tomto preparátu zjistit pro rychlý rozvoj plicního edému po podání protilátky [7].

Tyto výsledky prokázaly, že Kv2.1 je klíčový pro udržování klidového membránového potenciálu v buňkách hladkého svalu periferních plicních arteriol, zatímco Kv1.5 je podstatný pro iniciaci HPV. Toto zjištění ovšem okamžitě vyvolalo novou otázku: jak může Kv1.5 vyvolávat vazokonstrikci, když jeho selektivní inhibice (protilátkou) nevede k depolarizaci? Domníváme se, že vysvětlení může spočívat v hypoxické inhibici Kv2.1 kanálu, což by vedlo k depolarizaci buňky na úroveň, kde se již hypoxické změny aktivity Kv1.5 mohou projevit další depolarizací. Tuto hypotézu je ovšem třeba experimentálně ověřit. Schopnost hypoxie snižovat aktivitu Kv2.1 v hladkém svalu plicních cév byla experimentálně doložena [8].

Abychom komplementárním metodologickým přístupem ověřili klíčovou roli Kv1.5 kanálu v HPV, využili jsme dostupnosti myší, jimž byl odstraněn gen pro alfa podjednotku Kv1.5 [9]. Jak jsme očekávali, HPV byla u těchto zvířat výrazně zredukována. Tento nález sice na jedné straně potvrdil podstatnou roli Kv1.5 kanálů v HPV, na druhé straně ovšem doložil, že hypoxické snížení aktivity Kv1.5 kanálu není jediným podkladem HPV. Hypoxická reaktivita totiž nebyla u geneticky manipulovaných myší kompletně zrušena [9]. Identita těchto dalších mechanismů je předmětem dalšího výzkumu.

Jakousi vedlejší, avšak perspektivní "větví" našeho výzkumu mechanismu HPV jsou pokusy týkající se hypoxické vazokonstrikce ve fetoplacentárních cévách [10]. Na ně jsme se zaměřili proto, že jedna z jejich hlavní funkcí - okysličování krve a odstraňování CO2 - je identická s funkcí plicních cév. Předpokládali jsme, že vzhledem k analogii funkce by se mohly uplatňovat obdobné regulační mechanismy. Hlavním regulačním mechanismem plicních cév je HPV. Odpověď fetoplacentárních cév na hypoxii je prakticky neprobádaná. Očekávali jsme, že akutní hypoxie může ve fetoplacentárních cévách vyvolávat vazokonstrikci, což jsme také prokázali [10]. Zde je na místě připomenout, že cévy všech ostatních orgánů na hypoxii buď neodpovídají, nebo dilatují.

Pokračujíc v analogii s HPV, předpokládali jsme, že i v případě hypoxické fetoplacentární vazokonstrikce (HFPV) je klíčem k mechanismu hypoxická inhibice K kanálů. Metodou polymerázové řetězové reakce s reverzní transkripcí jsme zjistili expresi řady typů K kanálů v hladkém svalu fetoplacentárních cév, včetně Kv1.5 a Kv2.1. Elektrofyziologicky jsme prokázali, že hypoxie reverzibilně inhibuje Kv kanály v hladkém svalu fetoplacentárních cév. Navíc inhibitor Kv kanálů 4-aminopyridin simuluje efekt hypoxie na cévní rezistenci ve fetální části perfundované lidské placenty. Perfuzní tlak zvýšený 4-aminopyridinem se pak již dále nezvyšuje při expozici akutní hypoxii. To ukazuje, že inhibice Kv kanálů je skutečně podkladem HFPV [10]. Možná účast jiných typů K kanálů je předmětem naší současné práce.

Dohromady tyto naše studie spolu s dalšími publikovanými výzkumy naznačují, že inhibice K kanálů je obecným mechanismem akutní hypoxické aktivace tkání zodpovědných za přísun kyslíku do organismu (karotická tělíska, plicní a fetoplacentární cévy, snad podíl na tvorbě erytropoietinu) [11].


Chronické účinky hypoxie

Akutní i chronická hypoxie vedou ke zvýšení tlaku v plícnici. Mechanismus těchto dvou jevů je však diametrálně odlišný. Především akutní hypoxie působí pouze plicní vazokonstrikci, zatímco chronická hypoxie navíc působí rozsáhlou přestavbu morfologie stěny plicních cév. Mění se struktura endotelu, přibývá hladkého svalu a pojivové tkáně. Cévní stěna se tím stává tužší a její odpor krevnímu proudu roste. K tomu přispívá i to, že hladký sval roste "dovnitř", cévní lumen se tedy zužuje [12, 13]. Chronická hypoxická plicní hypertenze vážně komplikuje průběh a prognózu řady chronických plicních a oběhových chorob, nicméně její mechanismus není o nic jasnější, než mechanismus akutní HPV.

Naše poznatky u úloze K kanálů v mechanismu akutní HPV nás vedly k otázce, zda se tyto kanály nemohou uplatňovat i v rozvoji chronické hypoxické plicní hypertenze. To by bylo možné jednak jejich vlivem na cévní tonus, anebo jejich schopností prostřednictvím změn membránového potenciálu ovlivňovat [Ca2+]i, který je zase významným regulátorem proliferace [4, 14]. Je známo, že prolongovaná hypoxie vede ke snížení aktivity (a možná i exprese) K kanálů včetně Kv a Ca2+-dependetních K kanálů (KCa) [15, 16]. Využili jsme poznatku, že lidem běžně bezpečně podávaná látka, dehydroepiandrosteron (DHEA), byla popsána jako selektivní aktivátor KCa kanálů v plicních cévách [17]. Předpokládali jsme, že pokud by snížená aktivita KCa kanálů přispívala k rozvoji plicní hypertenze, pak by jejich farmakologická stimulace měla tuto poruchu omezovat. Testy na laboratorních potkanech tuto hypotézu plně potvrdily - podávání DHEA potkanům nejen předešlo plnému rozvoji plicní hypertenze, ale dokonce oslabilo plicní hypertenzi po té, co už plně rozvinutá byla [19].

Určitá nejasnost, kterou tyto slibné výsledky zanechávají, souvisí s tím, že DHEA je nejen aktivátor KCa kanálů, ale také účinný antioxidant. Přitom existují údaje, které ukazují, že produkce kyslíkových radikálů při chronické hypoxii stoupá. Abychom ověřili jejich možnou úlohu při rozvoji plicní hypertenze, podávali jsme potkanům osvědčený antioxidant, N-acetyl cystein, během jejich expozice chronické hypoxii [20, 20a]. Tato léčba skutečně vedla k signifikantně nižšímu stupni plicní hypertenze, což potvrdilo významnou, i když ne exkluzivní úlohu radikálů v mechanismu chronické hypoxické plicní hypertenze.

Mechanismů, kterými by změny jak kyslíkových radikálů, tak aktivity K kanálů mohly vést až ke konečnému komplexnímu obrazu plicní hypertenze, si lze představit celou řadu. Jednou z významných možností je ovlivnění metabolismu kolagenu v cévní stěně. Je dobře známo, že přibývání kolagenu v cévní stěně při plicní hypertenzi je provázeno změnou jeho struktury a zvýšením kolagenolytické aktivity [21]. Jak kyslíkové radikály, tak intracelulární Ca2+ (jehož průnik do buněk je do značné míry řízen aktivitou K kanálů prostřednictvím depolarizace) mají schopnost ovlivňovat aktivitu klíčových kolagenolytických enzymů - metaloproteináz. Proto jsme se rozhodli posoudit úlohu metaloproteináz v rozvoji chronické hypoxické plicní hypertenze. K tomu jsme použili jejich selektivního inhibitoru batimastatu. V souladu s naším očekáváním se ukázalo, že podávání batimastatu potkanům po dobu jejich několikatýdenní expozice hypoxii podstatně omezilo jejich plicní hypertenzi [22]. Vzrůst aktivity metaloproteináz je tedy pro rozvoj plicní hypertenze podstatný. Kauzální souvislost mezi K kanály, kyslíkovými radikály a aktivitou metaloproteináz při chronické hypoxii zbývá objasnit.


Pozdní účinky hypoxie


Účinky akutní a chronické hypoxie na plicní cirkulaci jsou studovány celou řadou laboratoří několik desetiletí. Koncem osmdesátých let jsme se začali zabývat tehdy novou - a ostatně dodnes nepříliš probádanou - myšlenkou, že hypoxický inzult může mít na plicní cirkulaci podstatně dlouhodobější důsledky, působí-li v období kolem narození. Podhoubím této hypotézy byl zejména koncept tzv. kritických vývojových period. Jde o to, že vývoj každého orgánu má poměrně krátká období, během nichž je zvýšeně citlivý na patogenní vlivy. V případě plicní cirkulace bylo logické z tohoto hlediska pomýšlet na perinatální období, protože právě v této době prodělává velmi rychle hluboké změny, jaké nemají v jiných cévních řečištích obdoby. Zatímco průtok plicním řečištěm během prvních minut a hodin po narození mnohonásobně roste, tlak klesá na zlomek prenatální úrovně. Podobně dramatické změny nastávají ve stavbě cévní stěny.

K ověření naší hypotézy jsme vystavili samce laboratorního potkana hypoxii v době narození a pak je nechali vyrůstat v normálních podmínkách na vzduchu. Když zvířata dospěla, vykazovala tendenci ke zvýšenému tlaku v plícnici těsně pod hranicí statistické významnosti. Co však značně významné bylo, byla hyperreaktivita jejich plicních cév na akutní hypoxii v období zotavení z chronické hypoxické expozice v dospělosti [24]. Další studie ukázaly řadu dalších drobnějších odchylek ve funkčních vlastnostech plicních cév v dospělosti způsobených krátkou hypoxickou episodou v perinatálním období [25]. Podstatné je, že všechny tyto změny byly charakteristické právě pro perinatální období. Nenacházeli jsme je totiž u zvířat, která byla vystavena zcela identickému režimu, avšak v jiném životním období. V poslední době jsme zjistili, že na dlouhodobé důsledky perinatální hypoxie jsou nápadně citlivější samice než samci [26]. V tomto kontextu je zajímavé, že citlivost na chronickou hypoxii v dospělosti je naopak větší u samců. Rozdíl v citlivosti na perinatální hypoxii se nezdá být způsoben pohlavními hormony. Právě naopak, samičí pohlavní hormony opožděné následky perinatální hypoxie spíše tlumí. [26]. Na této slibné problematice, která může mít souvislost s častějším výskytem plicní hypertenze u mladých žen v období hormonálních výkyvů, v současnosti dále pracujeme.

Naše výsledky tedy ukazují, že akutní působení hypoxie na plicní a fetoplacentární cévy je podmíněno inhibicí Kv kanálů hladkého svalu a následnou depolarizací, influxem Ca2+ a vasokonstrikcí, zatímco pro dlouhodobé působení hypoxie, kde se K kanály rovněž uplatňují, je významnější produkce kyslíkových radikálů aktivujících metaloproteinázy a následná strukturální přestavba plicních cév. Jak akutní, tak dlouhodobé působení hypoxie může být významně modulováno dlouhodobými důsledky hypoxie působící v kritickém perinatálním období.



Literatura

  1. von Euler US and Liljestrand G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol Scand 12: 301-320, 1946.
  2. McMurtry IF, Davidson AB, Reeves JT, and Grover RF. Inhibition of hypoxic pulmonary vasoconstriction by calcium antagonists in isolated rat lungs. Circ Res 38: 99-104, 1976.
  3. Cornfield DN, Stevens T, McMurtry IF, Abman SH, and Rodman DM. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am J Physiol 265: L53-L56, 1993.
  4. Nelson MT, Patlak JB, Worley JF, and Standen NB. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. Am J Physiol 259: C3-C18, 1990.
  5. Post JM, Hume JR, Archer SL, and Weir EK. Direct role for potassium channel inhibition in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am J Physiol 262: C882-C890, 1992.
  6. Archer SL, Huang JMC, Reeve HL, Hampl V, Tolarová S, Michelakis E, and Weir EK. Differential distribution of electrophysiologically distinct myocytes in conduit and resistance arteries determines their response to nitric oxide and hypoxia. Circ Res 78: 431-442, 1996.
    6a. Falus F, Herget J, and Hampl V. Almitrine in low dose potentiates vasoconstrictor responses of isolated rat lungs to moderate hypoxia. Eur Respir J 4: 688-693, 1991.
    6b. Abenhaim L, Moride Y, Brenot F, Rich S, Benichou J, Kurz X, Higenbottam T, Oakley C, Wouters E, Aubier M, Simonneau G, and Bégaud B. Appetite-suppressant drugs and the risk of primary pulmonary hypertension. N Engl J Med 335: 609-616, 1996.
    6c. Weir EK, Reeve HL, Huang JMC, Michelakis E, Nelson DP, Hampl V, and Archer SL. Anorexic agents aminorex, fenfluramine, and dexfenfluramine inhibit potassium current in rat pulmonary vascular smooth muscle and cause pulmonary vasoconstriction. Circulation 94: 2216-2220, 1996.
    6d. Belohlávková S, Simák J, Kokesová A, Hnilicková O, and Hampl V. Fenfluramine-induced pulmonary vasoconstriction: role of serotonin receptors and potassium channels. J Appl Physiol 91: 755-761, 2001.
  7. Archer SL, Souil E, Dinh-Xuan AT, Schremmer B, Mercier J-C, El Yaagoubi A, Nguyen-Huu L, Reeve HL, and Hampl V. Molecular identification of the role of voltage-gated K+ channels, Kv1.5 and 2.1 in hypoxic pulmonary vasoconstriction and control of resting membrane potential in rat pulmonary artery myocytes. J Clin Invest 101: 2319-2330, 1998.
  8. 8. Hulme JT, Coppock EA, Felipe A, Martens JR, and Tamkun MM. Oxygen sensitivity of cloned voltage-gated K+ channels expressed in the pulmonary vasculature. Circ Res 85: 489-497, 1999.
  9. Archer SL, London B, Hampl V, Wu X, Nsair A, Puttagunta L, Hashimoto K, Waite RE, and Michelakis ED. Impairment of hypoxic pulmonary vasoconstriction in mice lacking the voltage gated potassium channel, Kv1.5. FASEB J 15: 1801-1803, 2001.
  10. Hampl V, Bíbová J, Stranák Z, Wu X, Michelakis ED, Hashimoto K, and Archer SL. Hypoxic fetoplacental vasoconstriction in humans is mediated by potassium channel inhibition. Am J Physiol Heart Circ Physiol 283: H2440-H2449, 2002.
  11. López-Barneo J, Pardal R, and Ortega-Sáenz P. Cellular mechanism of oxygen sensing. Annu Rev Physiol 63: 259-287, 2001.
  12. Herget J, Wilhelm J, Novotná J, Eckhardt A, Vytásek R, Mrázková L, and Ostádal M. A possible role of the oxidant tissue injury in the development of hypoxic pulmonary hypertension. Physiol Res 49: 493-501, 2000.
  13. Hampl V and Herget J. Role of nitric oxide in the pathogenesis of chronic pulmonary hypertension. Physiol Rev 80: 1337-1372, 2000.
  14. Clapham DE. Calcium signaling. Cell 80: 259-268, 1995.
  15. Peng W, Hoidal JR, Karwande SV, and Farrukh IS. Effect of chronic hypoxia on K+ channels regulation in human pulmonary vascular smooth muscle cells. Am J Physiol 272: C1271-1278, 1997.
  16. Evans AM, Osipenko ON, Haworth SG, and Gurney AM. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Am J Physiol 275: H887-H899, 1998.
  17. Farrukh IS, Peng W, Orlinska U, and Hoidal JR. Effect of dehydroepiandrosterone on hypoxic pulmonary vasoconstriction: a Ca2+-activated K+-channel opener. Am J Physiol 274: L186-L195, 1998.
  18. Hampl V, Bíbová J, Povysilová V, and Herget J. Dehydroepiandrosterone sulfate reduces experimental pulmonary hypertension in rats. Eur Respir J 21: 862-865, 2003.
  19. Herget J, Bíbová J, and Hampl V. Antioxidant N-acetylcysteine inhibits development of hypoxic pulmonary hypertension in rats. J. Vasc. Res. 35:5, 1998.
  20. Lachmannová V, Hniličková O, Povýšilová V, Hampl V, and Herget J. N-acetylcysteine inhibits hypoxic pulmonary hypertension most effectively in the initial phase of chronic hypoxia. Life Sci 77 :175-182, 2005.
  21. Novotná J and Herget J. Exposure to chronic hypoxia induces qualitative changes of collagen in the walls of peripheral pulmonary arteries. Life Sci 62: 1-12, 1998.
  22. Herget J, Novotná J, Bíbová J, Povysilová V, Vanková M, and Hampl V. Metalloproteinase inhibition by Batimastat attenuates pulmonary hypertension in chronically hypoxic rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 285: L199-L208, 2003.

  23. Hampl V and Herget J. Perinatal hypoxia increases hypoxic pulmonary vasoconstriction in adult rats recovering from chronic exposure to hypoxia. Am Rev Respir Dis 142: 619-624, 1990.
  24. Hampl V, Bíbová J, and Herget J. Perinatal history of hypoxia leads to lower vascular pressures and hyporeactivity to angiotensin II in isolated lungs of adult rats. Physiol Res 49: 567-575, 2000.
  25. Hampl V, Bíbová J, Ostádalová I, Povysilová V, and Herget J. Gender differences in the long-term effects of perinatal hypoxia on the pulmonary circulation in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 285: L386-L392, 2003.

V. Hampl, Ústav Fyziologie 2.LF UK, Plzeňská 311, Praha 5         vaclav.hampl@lf2.cuni.cz

Set up a website - More